苯二氮卓类药物是临床最常用的镇静药物，但在临床应用中发现，苯二氮卓类药物副作用较多，容易引起医源性和自发性过量用药。作用部位的复杂性是导致苯二氮卓类药物药效学复杂的主要原因，因此开发位点特异性药物将有助于减少其副作用。
2023 年 8 月 21 日，由北京大学药学院黄卓团队发表于 Acta Physico-Chimica Sinica 的研究：Identification of Novel GABAA Receptor Positive Allosteric Modulators with Novel Scaffolds via Multistep Virtual Screening，使用 TargetMol 化合物库数据，通过虚拟筛选，发现了一种 具有新型母核的中度镇静药物——GPR120。
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GABAA 受体属于 Cys-Loop 配体门控离子通道受体超家族。它们主要介导哺乳动物中枢神经系统的抑制性信号传递，参与调节睡眠唤醒、学习记忆、疼痛等多种生理现象，它的功能异常可引起癫痫、抑郁、失眠等神经精神疾病。
GABAA 受体通常是由两个 α 亚基、两个 β 亚基和一个 γ 亚基组成的配体门控氯离子通道。在激动剂 GABA 与受体结合后，通道打开，细胞外氯离子流入，产生抑制超流电流。不同的亚基可形成多种不同的 GABAA 受体亚型，其中 α1β2γ2 亚型在中枢系统中占多数。GABAA 受体 α/γ 界面的胞外端是苯二氮卓类药物（BZD）的高亲和力位点。苯二氮卓类药物作用于 α/γ 界面，通过增强 GABA 的作用，表现出镇静催眠、抗焦虑和抗癫痫等药理作用。
发现新型GABAA受体活性变构调节剂
最新研究中，通过使用 CDK 指纹对化合物进行主成分分析，研究人员发现诱导分子的加入可以有效扩大阴性分子的化学空间分布，从而使数据集的构建更接近真实的药物筛选情况——即阴性分子远远多于阳性分子。
为了在机器学习模型中找到优化的参数，他们在训练集和验证集中执行了 10 倍交叉验证和网格搜索。基于 MCC 马修斯相关系数最终选择 CDK_LR 模型 作为虚拟筛选模型，并对 TargetMol 数据库中的 41,112 个化合物进行预测，得到 1,023 个有效化合物用于虚拟筛选。
在分子对接的重对接实验中，6D6T 和 6D6U 构象中 FYP 分子的 vina 评分分别为 -9.4 kcal/mol 和 -9.6 kcal/mol。6D6T 中 vina 分数小于 -9.4 kcal/mol 的分子和 6D6U 中 vina 分数小于 -9.6 kcal/mol 的分子被视为阳性分子。同时，重对接的构象和实验结果相比，RMSD 均小于 2Å。这说明，分子对接模型及其参数是合理的。
富集打分也同样说明了该对接模型可以信任。进行虚拟筛选后，在 6D6T 和 6D6U 构象的交集结果中，最终得到了 105 个预测阳性化合物。然后用 MMGBSA 法对这些化合物进行筛选。结合能最低的前 20 个化合物作为 6D6T 和 6D6U 构象的有效化合物，然后取交集。交集中共有 16 个化合物被预测为先导化合物。
进一步，为了验证该机器学习模型是合理且有效的，研究人员构建了基于深度学习的基线模型，包括 信息传递网络模型 （MPNN）以及 基于课程学习的图注意力模型 （CurrMG_GAT）。这两种基线模型在训练集中的训练误差如下图所示。
在模型达到收敛后，研究人员对使用的 CDK-LR 模型与这两种基线模型进行了比较。这些模型在测试集中的表现如下表所示。可以看出，CDK-LR 模型能够得到更为准确的预测。这说明，在这一预测任务中，没有必要使用基于深度学习的复杂模型进行建模，这可能是由于目前已有的化合物数据有限所致。
接下来，为了验证这 16 个先导化合物，研究人员在表达 GABAA 受体（α1β2γ2）的 HEK293 细胞进行了全细胞电压钳实验。在 10µM 下进一步观察地西泮 (阳性对照) 和 GPR120 对 α1β2γ2 受体的影响。
发现，地西泮（10µM）和 GPR120 对 α1β2γ2 受体有明显的调节作用
，使 EC3-10 GABA 电流增强至 189.4±16.2% 和 171.5±17.7%，苯二氮卓类拮抗剂氟马西尼(10µmol/L)显著拮抗增强作用。GPR120对GABA电流增强的EC50为13.4 μmol/L。
对于 GPR120 和 GABAA 受体，研究人员想要找出结合过程中的关键氨基酸残基，因此利用点突变来探索其精确位置。
在 HEK293 细胞中重组表达 α1β2γ2 受体后，α1 亚基（α1102H）的 102 位组氨酸发生突变，地西泮和 GPR120 的激活作用明显降低。以上结果证明 GPR 可以通过 α1102H 位点发挥激动作用，与 DZP 相似。
接下来研究人员在动物实验中进行了验证。通过给小鼠腹腔注射 DZP (3 mg/kg)、GPR (5、10、20 mg/kg) 和生理盐水，30 分钟后记录小鼠的运动距离。
结果显示，与生理盐水组相比，DZP 显著降低小鼠的自发活动，且注射后 6 小时仍有作用。GPR120 对小鼠自发活性的抑制作用呈剂量依赖性，在 20mg/kg 活性剂量下可显著降低小鼠自发活性，但注射 6h 后，对小鼠自发活性的抑制作用消失。
提示 GPR120 为中度镇静作用。
在戊巴比妥钠（PB）诱导翻正反射小时试验中，与生理盐水组相比，DZP (3 mg/kg) 可显著缩短 LORR 启动时间，延长 LORR 持续时间。GPR120 在剂量为 20 mg/kg 时与 DZP 效果相同。结果表明，GPR120 可增强 PB 诱导的翻正反射丧失。
为了论证 GPR120 母核结构的新颖性，研究使用 CDK 分子指纹对 GPR120 和已有的阳性化合物进行了 tSNE 降维分析并对谷本相似度进行了计算。在 tSNE 的分布散点图中，GPR120 周围并没有发现已有的阳性化合物。和 GPR120 最相似的已有的三个阳性化合物的谷本相似度分别为 0.2024，0.2022 和 0.1935. 这些结果表明，和已有的阳性化合物相比，GPR120 具有全新的母核。
小结
综上，该研究通过集成虚拟筛选方法和全细胞膜片钳电生理实验，发现了 4 种结构新颖的 GABAA 受体正性变构调节剂。其中，化合物 GPR120 在细胞水平和动物水平均得到实验验证，是一种具有新型母核的中度镇静药物。
北京大学药学院黄卓为该研究的通讯作者，孔维恺忻，廉靖靖，彭超为该研究的共同第一作者。
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